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本试剂盒为检测细胞凋亡、病理或者正常细胞而开发设计的。凋亡是细胞为避免诱发炎症反应而自主发生细胞有序死亡的过程。在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸从胞内移位到胞外表面，因此磷酯酰丝氨酸出现在细胞的外表面可以作为细胞凋亡的起始或者中间阶段的通用指示器，也可以通过其形态学改变来测定。该试剂盒中磷酯酰丝氨酸指示剂结合膜上的磷酯酰丝氨酸后，产生绿色荧光(Ex/Em = 490/525nm)。坏死则是以被动性和偶然性为特点的细胞死亡，起因于不受控制的外界环境改变，并导致炎症因子的释放。在晚期凋亡和坏死中，通过无膜渗透能力的深红色荧光染料7-AAD (Ex/Em = 546/647nm)，可以标记细胞核（因为这些细胞的细胞膜是不完整的）。此外，这个试剂盒也提供活细胞蓝色荧光染料Cyto Calcein Violet 450 (Ex/Em = 405/450nm)来标记活细胞的细胞质。本试剂盒通过流式和荧光显微镜能最佳检测细胞凋亡（绿色），坏死（红和/或者绿色）以及正常细胞（蓝色）。

• 准备细胞及用Apopxin Green孵育染色：
  
  • 用药物处理细胞，诱导细胞凋亡（十字孢碱4～6小时诱导Jurkat细胞凋亡）。
    
  • 离心收集细胞，1～5×10⁵cells/管。
    
  • 用200μL Assay Buffer (组分B)重悬细胞；
    
  • 加入2μL Apopxin Green（组分A）到上述细胞悬液中；
    
  • 选做1：加入1μL 200X 7-AAD（组分C）到细胞悬液检测细胞坏死；
    
  • 选做2：200X CytoCalcein Violet 450储备液的制备：取100μL DMSO加入到一支CytoCalcein Violet 450 (组分D)，混匀；加入1μL 200X CytoCalcein Violet 450到细胞悬液检测活细胞；
    
  • 室温，避光孵育30～60分钟；
    
  • 在使用流式细胞仪或荧光显微镜检测之前可以加入300 Assay Buffer μL (组分B)重悬细胞，以增加细胞悬液的体积，方便流失细胞检测或荧光显微镜检测。
    
  • 经过处理的细胞此时可以在流式细胞仪上或荧光显微镜检测分析：Ex/Em = 490/525检测细胞凋亡，Ex/Em=550/650检测细胞坏死，Ex/Em=405/450检测活细胞；
• 流失细胞仪检测分析：
  
  • 对于贴壁细胞，本试剂盒在流式细胞检测过程中，细胞消化，离心等过程要轻柔，尽量避免人为损伤的细胞，引起假阳性。
  • 当加入Apopxin Green时，波长Ex/Em = 490/525nm用于检测细胞凋亡；
    
  • 当加入7-AAD时，波长Ex/Em = 490/650nm用于检测细胞坏死；
    
  • 当加入Apopxin Green时，波长Ex/Em = 405/450用于检测活细胞；
• 荧光显微镜检测分析：
  
  • 对于贴壁细胞，建议直接将细胞接种在盖玻片上（或96孔板中）。用Apopxin Green (步骤1.e)孵育后，使用Assay Buffer (组分B)冲洗1～2次；再将Assay Buffer (组分B)滴加在盖玻片（或96孔板中）；然后，将盖玻片倒放在载玻片上（细胞贴近载玻片）。
    
  • 在贴壁细胞用Apopxin Green (步骤1.e)孵育后可以用2%甲醛对细胞进行固定，并在显微镜下观察。
  • 用移液器吸取（步骤1.e）细胞悬浮液，使用Assay Buffer (组分B)洗涤1～2次；再用Assay Buffer (组分B)重悬细胞，然后，将细胞悬液滴加到载玻片上，并用盖玻片封片（或将细胞悬液滴加到黑色/透明底部的96孔微量培养板中）。
    
  • 在荧光显微镜下通过FITC通道检测Apopxin Green荧光强度，分析细胞凋亡情况；通过Texas Red channel检测7-AAD荧光强度，分析细胞坏死情况；通过Violet channel检测CytoCalcein Violet 450荧光强度，分析活细胞情况。细胞质膜上的绿色染色说明了Apopxin Green结合了细胞表面的磷酯酰丝氨酸。